概要
遺伝子発現に大きく影響を与えることが知られているmiRNAや、スプライシングに関わるとされるSmall nuclear RNA（snRNA）などのSmall RNAを網羅的に解析します。特にエクソソーム中のmiRNAの解析に関して実績が豊富にあります。
特長
miRNA-Seq・Small RNA-Seqでもさまざまな試料に対応した解析を行っております。
- 細胞・組織由来のtotal RNA
- 血清・血漿 由来total RNA
- 培養上清・血中エクソソームRNA
細胞や組織由来RNAのほか、血清、血漿由来のセルフリーRNA（cfRNA）にも対応しており、近年、盛んに研究されているリキッドバイオプシーについても解析することができます。リキッドバイオプシーは、体液に含まれる核酸を検出する技術であり、がんの検査などにも使われるようになってきました。とくにエクソソーム中のmiRNAの解析に関しては実績が豊富にあり、近年では動脈硬化疾患に関するプロジェクトに参画（2021年1月14日プレスリリース）しております。
【解析対象に応じて下記のキットをご利用いただけます。】
- miRNA-Seq（miRNA，piRNA）の場合：QIAseq miRNA Library Kit（Qiagen社）
＊分子バーコードUnique Molecular Indices（UMI）対応。PCRやシークエンスバイアスを最小限にし、個々のmiRNAを定量するように設計されています。
- Small RNA-Seq（miRNA，siRNA，piRNA，scRNA，snoRNA）の場合：SMARTer smRNA-Seq Kit for illumina（Clontech）
【対応する生物種】
miRNAについては，miRBaseに搭載している生物種であれば基本的に解析可能です。
miRBaseはmiRNAの配列情報やアノテーション情報に関するデータベースで広く利用されています。
解析の流れ
- 試料のクオリティチェック（QC）を行います。
- miRNAまたはSmall RNAを対象としたシークエンスライブラリーを調製します。
＊ライブラリー調製試薬
QIAseq miRNA Library Kit（Qiagen社）
SMARTer smRNA-Seq Kit for illumina（Clontech社）
- 調製したシークエンスライブラリーはQC後、illumina社の次世代シークエンサー（NextSeq 500、NovaSeq 6000、Hiseq Xなど）でシークエンスします。
- シークエンス後のデータは、リファレンスゲノムにアライメント（マッピング）後、発現量を定量化（正規化）し、アノテーション情報を含むExcel形式のファイルを作成します。デフォルトでは、TMMで定量化します。ご要望に応じて、発現変動遺伝子抽出、時系列解析、ターゲット遺伝子予測などの解析を実施します。正規化以降の解析をご依頼いただいた場合には、 6試料以上の場合で階層的クラスタリングと主成分分析（PCA）を行います。
データ解析
miRNAの解析（ ライブラリー調製キット：QIAseq miRNA Library Kit ）
- リードの品質の評価を行います。
- QIAGEN社CLC Genomics Workbenchによりにより、シークエンスで得られたリードをリファレンスゲノムにアライメント（マッピング）後、分子バーコード（UMIs）によるPCR重複の除去を行い、リードカウントをします。
- 試料間のリードカウントを補正するために正規化を行います。
- ご指定の比較に沿って、変動するmiRNAなどを抽出します。
- miRNAが標的とする遺伝子予測を行います。遺伝子予測データベースであるTargetScanなどを利用します。
- 予測された遺伝子リストについてGO解析で特徴的なGO Termを抽出します。複数ある遺伝子の特徴を客観的につかむことが出来ます。
- Pathway解析では、Wikipathwaysに登録されたPathway上に、予測された遺伝子をmiRNAの発現情報（UP/DOWN）で色分けしPathway画像を作成します。さらに予測された遺伝子を有意に多く含むPathwayを絞り込むことができます。
＊ 解析内容は
統計解析（データ解析）のページをご参照下さい。
Small RNAの解析（ ライブラリー調製キット：SMARTer smRNA-Seq Kit for illumina）
- リードの品質の評価を行います。
- シークエンスで得られたリードをリファレンスゲノムにアライメント（マッピング）します。
- small RNA組成の分類を行います。
- 試料間のリードカウントを補正するために正規化を行います。
- 階層的クラスタリングと主成分分析（PCA）を行います（6試料以上の場合）。
- ご指定の比較に沿って、変動するmiRNAおよびSmall RNAなどを抽出します。
- miRNAが標的とする遺伝子予測を行います。
- 予測された遺伝子リストについてGO解析で特徴的なGO Termを抽出します。
- 予測された結果をもとに得られた全遺伝子をPathway上にマッピングし、Pathway画像を作成します。さらに予測された遺伝子を有意に多く含むPathwayを絞り込むことが出来ます。
＊ 解析内容は
統計解析（データ解析）のページをご参照下さい。
納品物例
（
fig.1）（
fig.2）（
fig.3）
miRNAの解析（ ライブラリー調製キット：QIAseq miRNA Library Kit ）
- original_fastq（FASTQ生データ）
- 試料QC結果（品質検査結果）
- データQC結果（FastQC、MultiQC）
- データ解析結果：正規化、変動miRNA抽出、標的遺伝子予測、GO解析、Pathway解析
Small RNAの解析（ ライブラリー調製キット：SMARTer smRNA-Seq Kit for illumina）
- original_fastq（FASTQ生データ）
- Trimmed_fastq（トリミング済みFASTQ）
- Bam（アライメントデータ）
- 試料QC結果（品質検査結果）
- データQC結果（FastQC、MultiQC）
- データ解析結果：正規化、変動miRNA抽出、変動Small RNA抽出、標的遺伝子予測、GO解析、Pathway解析
＊ USBメモリ等の記憶媒体もしくはクラウド経由で納品します。
必要試料量について
|
RNA量 |
OD260/280 |
RIN値 |
送付液量 |
total RNA
（microRNA含む） |
1μg以上 |
1.5以上 |
8以上 |
10μL以上 |
| 濃縮Small RNA |
500ng以上 |
1.5以上 |
－ |
10μL以上 |
エクソソーム画分由来
total RNA（miRNA含む） |
1ng程度 （＊1） |
－ |
－ |
10μL以上 |
| RNA抽出する血清または血漿 |
－ |
－ |
－ |
400μL以上 |
| エクソソーム画分 |
（＊2） |
－ |
－ |
（＊2） |
エクソソーム分離後にRNA抽出をし
miRNA-seqをする
血清・血漿・培養上清 |
－ |
－ |
－ |
細胞培養上清：15mL以上
血清・血漿：2mL以上 |
＊1 エクソソーム分画由来total RNAは1ngからシークエンスライブラリー調製が可能ですが、全量で10ngを下回る試料はクオリティチェックが実施できません。
ご注意下さい。
＊2 超遠心等で分画したエクソソーム分画の送付量については、あらかじめご相談下さい。
＊ RNA抽出の際はカラムを使用し、有機溶媒が混入しないようにして下さい。
＊ 試料量が上記に満たない場合でも解析は可能ですが、必ずあらかじめご相談下さい
＊ 採血の際に使用する抗凝固剤はEDTAをお使い下さい。ヘパリン使用の場合には、ヘパリナーゼ処理が必要になります。
＊ 培養上清からエクソソームを分離して解析を行う場合、FBSにはウシ由来エクソソームが含まれているのでFBSフリーで培養することをおすすめします。
FBSフリーでの培養が困難な場合、ウシ胎児血清中のエクソソームを除去するキットのご利用をおすすめします。
＊送付方法は「サンプル送付方法」をご確認下さい。
