塩基多型を検出し、得られたSNPマーカーを用いて、系統解析や連鎖地図作成、QTLマッピングを行います。
| RAD-seq解析 | GRAS-Di® 解析 | MIG-seq解析 | ||
|---|---|---|---|---|
| （お客様） サンプルと情報のご提供 |
ゲノムDNA（＊1） >10ng/µL, >20µL |
ゲノムDNA（＊1） >15ng/µL, >20µL |
ゲノムDNA（＊1） >1ng/µL, >20µL |
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| ・冷蔵便または冷凍便で（株）生物技研社
へ送付ください。 ・8連チューブまたはプレートでお願いします。 ・GRAS-Di解析の場合は、DNA濃度測定の際のブランク用に溶出バッファーを100μLl程度サンプルと一緒にご送付ください（難しければ、バッファーの情報の提供をお願いします）。 ・サンプル送付時に、指定の依頼書をご提出ください。 |
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| ライブラリー作製 | ddRAD法を用いてライブラリーを作製します。使用する制限酵素はMspIと EcoRIの組み合わせですが、別の制限酵素からお選び頂くことも可能です。 | トヨタ自動車株式会社のプロトコールに従い、ライブラリーを作製します。 ①と②の２通りの方法があります。 ①DNBSEQのアダプター配列を付加したプライマーを用います。（＊2） ②イルミナ社のアダプター配列を付加したプライマーを用います。（＊2・＊3） |
Suyama et al., 2021. と同様の方法を用いて、ライブラリーを作製します。 | |
| シーケンス解析 | DNBSEQ 150bpペアエンド 1サンプルあたり100万リード程度 |
DNBSEQ 150bpペアエンド 1サンプルあたり100万リード程度 |
DNBSEQ 150bpペアエンド 1サンプルあたり100万リード程度 |
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| データ解析
目的に合わせいずれかの解析を行います |
GRAS-Di®解析ソフトウェアによる解析（￥100,000（税抜）） | 〇 | ジェノタイピング解析（￥80,000（税抜）） | 〇 | 〇 | 〇 |
| ┣ ＋系統解析（￥20,000（税抜）） | 〇 | 〇 | 〇 | |
| ┣ +structure解析（￥20,000（税抜）） | 〇 | 〇 | 〇 | |
| ┗ ＋遺伝的指数の算出（￥20,000（税抜）） | 〇 | 〇 | 〇 | |
| 連鎖地図作成（￥200,000（税抜）） | 〇 | 〇 | ||
| QTLマッピング（￥200,000（税抜）） | 〇 | 〇 | ||
＊1 試料を送付いただき、生物技研社でDNA抽出を行うことも可能です（DNA抽出費用￥24,000/8サンプル（税抜）、納期5営業日追加）。
＊2 生物技研社の試験では、①と②では異なる部位がシーケンシングされることがわかりました。継続的な解析の場合、以前と同一メーカーのアダプターを付加したプライマーを用いる方法をご選択ください。
＊3 ②は、リン酸化されたプライマーで2ndPCRを行った後、環状化させてDNBSEQでシーケンス解析します。イルミナ社シーケンサーでシーケンス解析した場合と同等の結果が得られることを検証済です。
| GRAS-Di®解析ソフトウェアによる解析 | GRAS-Di®解析ソフトウェアを用いて、アンプリコンごとのリード数やその配列、増幅断片のサイズ、遺伝子型などをExcelファイルで納品します。 |
| ジェノタイピング解析 | Stacksを用いてde novoアセンブルを行います。アセンブルされたカタログ配列に対し、各サンプルをジェノタイプします。レファレンスが利用できる場合は、レファレンスに対しジェノタイプします。 |
| 系統解析 | RAxML（GTR+gammaモデル）を用いた最尤法により系統樹を作成します。 |
| structure解析 | structureを使用して集団の遺伝的構成の違いを可視化します。 |
| 遺伝的指数の算出 | ジェノタイピング解析で得られたSNPデータと指定のグループ分け情報を使用し、Stacksで集団内と集団間（総当たり）の遺伝的指数（ヘテロ接合度の観察値と期待値、塩基多様度、近交係数、固定指数）を算出します。 |
| 連鎖地図作成 | Bowtieを用いてレファレンスにリードをマップした後、samtoolsとbcftoolsを用いて、SNPを検出致します。その後、vcftoolsを用いてSNPのフィルタリングを行います。遺伝子型データをもとにJoinmapを使用して、連鎖地図を作成致します。 |
| QTLマッピング | 連鎖地図作成と同様の方法で遺伝子型を決定した後、R/qtlを用いてQTL領域を推定致し、1,000回の並び替え検定で、5％有意水準を算出します。 |
| RAD-seq解析 | GRAS-Di®解析 | MIG-seq解析 | |
|---|---|---|---|
| ライブラリー作製様式 | 制限酵素 | PCR | |
| 塩基解読する領域 | 制限酵素部位の間 | ランダム | 単純反復配列（SSR）の間 |
| 得られる多型の数 | 多い（-100,000SNPs） | 少ない（-1,000SNPs) | |
| 適した解析名 | 遺伝子地図作成やqtl解析、集団解析 | 集団解析 | |
| 必要DNA量 | 多い（100ng以上） | 少ない（15ng） | 少ない（2～100ng） |
| DNAの品質 | 高品質のDNA量が必要 | 低品質のDNAでも可 | |
| 費用 | 高い | 安い | |
| RAD-seq解析 | GRAS-Di®解析・MIG-seq解析 | |||
|---|---|---|---|---|
| 価格（税抜） | ライブラリー調製 ￥50,000/8サンプル(＊4) | ライブラリー調製 ￥25,000/8サンプル(＊4) | ||
| シーケンス解析 ￥12,000/8サンプル ＊48サンプルまでは一律￥72,000 |
シーケンス解析 ￥12,000/8サンプル ＊48サンプルまでは一律￥72,000 |
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| データ解析 上記参照 | データ解析 上記参照 | |||
| 価格例 （税抜） |
48サンプル | ライブラリー調製 ￥300,000 シーケンス解析 ￥72,000 ジェノタイピング＋系統解析 ￥100,000 ———————————— 計￥472,000 （1サンプルあたり￥9,833） |
ライブラリー調製 ￥150,000 シーケンス解析 ￥72,000 ジェノタイピング＋系統解析 ￥100,000 ———————————— 計￥322,000 （1サンプルあたり￥6,708） |
|
| 96サンプル | ライブラリー調製 ￥600,000 シーケンス解析 ￥144,000 ジェノタイピング＋系統解析 ￥100,000 ———————————— 計￥844,000 （1サンプルあたり￥8,791） |
ライブラリー調製 ￥300,000 シーケンス解析 ￥144,000 ジェノタイピング＋系統解析 ￥100,000 ———————————— 計￥544,000 （1サンプルあたり￥5,666） |
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| 納期 | 25営業日 | GRAS-Di：30営業日（＊5）、MIG-seq：25営業日（＊5） | ||
| 納品物 | 以下のデータをDVD等の記録媒体に保存して納品します。 ・報告書 ・シーケンス生データ（fastq形式） ・DDBJのデータベース登録に必要なデータ ・データ解析結果（データ解析をご依頼いただいた場合のみ） |
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＊4 ライブラリー調製のみのご依頼は承っておりません。
＊5 500サンプルまでの納期です。500サンプル超の場合は追加納期がかかります。
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※お問い合わせは完了しておりません。
